어려서부터 정의감과 모험심이 가득 찬 '인디'(리버 피닉스 분)는 13세 보이스카웃 시절인 1912년, 도굴꾼이 16세기경에 제작된 코로나도 십자가를 훔치는 것을 보고 그것을 막으려 하나 아버지 헨리 박사(숀 코넬리 분)의 무관심으로 결국 실패하고 만다. 하지만 훗날 사용하게 될 그의 트레이드 마크인 중절모와 채찍을 얻게 된다. 세월이 흘러 고고학자로 성장한 인디(해리슨 포드 분)는 온갖 수난을 겪으면서 의 성궤 모험으로부터 2년 후인 1938년 포르투칼 해안의 풍랑이 요란한 어느 배 위에서 다시 그 십자가를 찾아내는 집념을 보인다. 십자가를 되찾은 박사는 자신이 재직 중인 바네트 대학으로 돌아오는데 몇 달만을 비워뒀던 대학 연구실엔 오래 전에 도착한 소포가 있었다. 소포 중에는 아버지의 일기장이었다. 고고학에 관심 많은 학생들을 피해 겨우 창문으로 빠져나온 존슨 박사는 윌터 도노반(줄리안 글로버 분)이라는 사람을 만난다. 도노반은 자신이 앙카라 북쪽에서 발견한 반쪽짜리 신의 석판의 탁본을 보여주며 헨리 박사의 일기장을 참고로 나머지 반쪽 석판과 예수가 최후의 만찬 때 사용했다는 술잔 성배를 찾아 달라고 부탁한다. 아버지 헨리 존스 박사도 역시 저명한 고고학자이다. 그는 예수가 최후의 만찬에서 사용한 성배의 위치에 대한 단서를 잡아서 이것을 찾던 중에 행방불명이 되었었다. 인디아나 존스는 아버지 헨리 존스 박사가 나치에게 납치 되었다는 소식을 듣고 베니스로 달려가는데...